Microscopy

지금까지 우리는 현미경의 역사와 구조에 대해서 이야기해 보았습니다. 다음은 다양한 관찰 방법들에 대해 알아보도록 하겠습니다.

Bright field 관찰은 가장 일반적인 관찰 방법로 관찰시 표본들은 최적의 contrast를 위해 염색되어야 합니다. 그러나 표본을 염색하기 어려운 샘플에 대응하기 위하여 다양한 여러 관찰방법들이 개발되었습니다.

표본이 살아있는 상태에서 관찰이 필요한 경우에는 관찰하고자 하는 염색을 할 수가 없습니다. 그래서 Bright Field(명시야) 관찰시에는 보다 contrast 를 높게 하여 관찰하여야 하기 때문에, 콘덴서의 N.A.값을 일반적인 condenser aperture setting보다 더 작게 설정하여야 합니다.

명시야 관찰법 이외에 콘덴서로부터 나온 빛이 대물렌즈로 직접 들어가지 않고, 표본에 맞고 산란된 산란광에 의해 표본을 관찰하는 방식인 암시야 관찰법이 있습다.

일반적으로 Dark Field(암시야) condenser는 고품질의 모델이 사용됩니다. 왜냐하면 대물렌즈의 조리개 보다 condenser의 조리개의 N.A. 값이 더 커야 암시야 관찰이 가능하기 때문입니다. Olympus BH2시리즈
는 immersion 과 dry 타입의 2가지 암시야 condenser를 가지고 있습니다.

암시야 관찰법에서는 직접광을 차단하기 위해 built-in iris diaphragm 기능이 포함되어 있는 높은 N.A.의 고배율 100X 대물렌즈가 사용되어 집니다. 만약, iris diaphragm을 너무 열고 사용하면 왼쪽 사진에 보이는 것 같이 flare가 발생됩니다. iris diaphragm을 조금 더 닫아주면 오른쪽에 보이는 것처럼 선명한 이미지를 볼 수 있습니다.

인간의 눈은 밝기와 색깔, 즉 빛의 파장과 진폭에 민감하기 때문에 contrast증가를 위해 표본은 일반적으로 염색되거나 고정되거나 슬라이드 글라스에 올려진 상태로 관찰되게 됩니다만, 이러한 과정은 살아있는 세포를 죽이기 때문에. 이런한 전처리를 하지 않는 상태에서 Bright Field(명시야) 관찰은 매우 어렵습니다.

그럼에도 불구하고, 살아있는 세포나 세포의 유사분열을 관찰하고 싶어하는 많은 연구자들이 있었습니다만, Bright Field(명시야) 관찰법은 이러한 욕구를 충족시키기 어료웠습니다.

1932년 네덜란드 물리학자 프리츠 제르니케(Frits Zernike)는 빛의 간섭 현상을 이용해 물체를 관찰하는 위상차현미경(phase contrast microscope)을 발명하여, 1953년 노벨 물리학상 수상의 영예를 안았습니다.

위상차 관찰법은 특수한 콘덴서 안에 있는 링 슬릿 조리개를 이용하였고,빛의 진행을 지연시켜 주는 둥근 위상판을 대물렌즈 안에 장착하였습니다.

위상차 관찰법은 일반 현미경에 오직 위상 콘덴서와 위상 대물렌즈를 추가하여 관찰이 가능하였기 때문에 매우 보편화되어 사용되고 있습니다. 녹색 필터는 종종 Contrast를 증가시키기 위해 사용합니다.

위상차 관찰법은 positive, negative contrast 모두에서 관찰이 가능 합니다. Positive contrast는 종종 세포와 분자의 내부 조직을 관찰시 사용되고, negative contrast는 낮은 contrast를 가진 물체의 형태나 물리적 운동의 관찰에 사용됩니다.

위상차 관찰법과 더불어 살아있는 세포와 같이 투명하여 Contrast가 매우 낮은 표본들의 관찰을 위한 다른 관찰법이 있습니다. 이 관찰법은 DIC관찰법(Differential interference contrast) 관찰법이라 불리고 다음 사진은 이 관찰법을 위한 부속장치들을 보여주고 있습니다.

미분간섭 관찰법은 링 슬릿 조리개와 위상판 대신 편광 필터와
개조된 Wollaston quartz 프리즘을 사용합니다.

미분간섭 관찰법은 후광이 없다는 점에서 위상차 관찰법의 단점을 해결하였고, 또한 물체의 경계를 명확히 구분지어 주며, 이미지를 뛰어난 명암으로 돋보이게 해 줄 수 있습니다. 게다가, 콘덴서의 조리개의 기능을 함께 사용할 수 있습니다. (위상차는 구조상 콘덴서의 조리개의 사용할 수 없습니다. )

형광 관찰법이라 불리는 또 다른 관찰방법은 형광이라는 현상을 사용합니다. 자외선 같이 특정 파장대의 빛을 비추면 몇몇 물질들은 그러한 파장을 흡수하고, 좀 더 파장이 좀더 긴 빛을 방출하게 됩니다. 이런한 현상을 이용한 것이 형광 관찰 현미경입니다.

엽록소나 몇몇 광물질들은 자연상태에서 이러한 형광을 발현합니다. 이러한 것들을 “자가 형광” 이라 합니다.

생물 표본의 자가형광은 매우 약하기 때문에 형광관찰 전에 형광염색
이나 형광색소가 첨가되어집니다. 형광은 형광물질 또는 이차형광에 의해 발광되어 관찰 될 수 있습니다.

투과조명 형광관찰법은 암시야용 콘덴서, 필터가 이용됩니다. 여기필터
는 광원에서 방출된 빛 중에서 원하는 특정 파장의 빛만 통과시킵니다. 표본의 형광 물질은 여기된 빛을 흡수하여 더 긴 파장대의 빛을 방출합니다. 이때 암시야 콘덴서는 여기광을 대물렌즈 광로에서 벗어나도록 방출시킵니다. Barrier filter는 남은 여기광들이 접안렌즈에 도달하지 못하도록 막아주게 됩니다. 따라서 어두운 배경에서 표본의 선명도와 Contrast가 커지게 만들 수 있습니다.

그러나, 반사조명 형광관찰법에서는 여기필터에 의해 여과된 짧은 파장의 여기광이 dichroic mirror를 통해 대물렌즈로 들어간다. 대물렌즈는 스스로 condenser 역할을 하고, 표본으로부터 방출된 형광은 대물렌즈로 되돌아옵니다. 그리고 dichroic mirror를 통과한 후 barrier filter를 거쳐 접안렌즈로 들어가게 됩니다.

지금부터는 편광관찰법에 대해 알아보기로 하자. 대부분의 물체들은 등방성이기 때문에 빛이 그것을 통과하여도 빛의 특성이 바뀌지 않는다. 하지만 방해석과 같은 물질은 빛이 그것들을 통과할 때 방향이 바뀐다. 이러한 물질은 anisotropic(이방성), birefringent(복굴절성)로 알려져 있다.

편광 관찰법은 이러한 birefringent 물질을 검사하기 위해 사용된다. Biredfringence(복굴절성)는 수정의 가장 특별한 특징 중에 하나이기 때문에 편광 관찰법은 바위, 광물, 수정 등의 연구에 이용된다.

Birefringence(복굴절성)는 또한 몇몇 생물학적 물질에서도 발생된다. 그래서 편광관찰법은 조직의 구조나 세포의 유사분열 등의 연구에 사용되기도 합니다.

Microscope System

이제 우리는 올림푸스 BH2 현미경 시리즈(구형모델)의 예를 들어 현미경의 구성에 대해 이야기하겠습니다.

일반 현미경의 기본요소는 접안렌즈, 대물렌즈, straight tube, 스테이지(stage), 반사경입니다.

현미경의 응용 범위가 넓어짐에 따라 각각의 주요 유닛들은 교체 가능한 종합적인 모듈로써 설계되어 있다. (모듈화)

OLYMPUS는 사용 용도에 따라 2가지 타입의 BH2 경통을 제공합니다. 일반적으로 접안렌즈 두개로 관찰을 위한 binocular와 사진촬영과 관찰을 동시에 할 수 있는 trinocular가 있습니다.

올림푸스의 trinocular tube는 빛의 경로선택에 따라 1. 100% 접안렌즈 관찰용, 2. 80% 사진촬영 및 20%의 접안렌즈 관찰용, 3. 100%의 사진촬영용으로 기능을 설정 할 수 있습니다.

올림푸스는 보통 widefield 모델보다 거의 2배 더 넓은 F.N. 26.5의 super widefield observation tube를 포함한 여러 observation tube타입들을 제공하며, Straight tube를 사용하여 사진 촬영장치만 연결할수도 있습니다.

또한 관찰자에게 가장 편안한 관찰자세를 제공하기 위해 0°~45° 범위의 각도조절이 가능하도록 디자인된 binocular observation tube와, trinocular observation tube(관찰 및 사진촬영용)와 같이 2가지의 tilting observation tube를 제공합니다.

multi-viewing attachment는 수업이나 토의 시 최대한 편리하게 고안된 accessory입니다. 이 Unit은 5명의 관찰자가 동시에 같은 샘플을 같은 배율, 같은 밝기를 가진 이미지로 볼 수 있게 해줍니다.

지금부터 nosepiece에 대해 이야기해 보겠습니다. 초기의 현미경은 대물렌즈가 하나만 달려 있었습니다.

그러나, 지금은 6개의 대물렌즈를 동시에 장착할 수 있는 revolving nosepiece의 사용이 일반화되어 있습니다.

Revolving nosepiece를 이용하면, 빠르고 편하게 다른 대물렌즈로 교환할 수 있습니다.

또한, 다양한 mechanical stage를 선택할 수 있습니다. 오른손용, 왼손용 low drive 컨트롤 모델, 수평 컨트롤 모델들, 회전이 가능한 모델, 그리고 대형 사이즈의 stage들을 사용 할 수 있습니다.

표본에 조명을 주는 가장 단순한 방법은 자연광을 거울로 반사하여 사용하는 것입니다. 그러나 자연광은 때때로 원하는 밝기 보다 약하거나, 날씨의 상태에 따라 조명의 강도를 제어하지 못하기 때문에, 원하는 강도의 조명을 원할히 사용하기 위하여 조명장치가 발달하게 되었습니다.

편리한 조작을 위해서 몇몇 현미경들은 본체에 조명장치를 내장하고 있고, 내부 광원의 밝기 조절 장치를 제공합니다. 일반적으로 텅스텐, 할로겐이 광원으로 사용되고 있으며, 올림푸스 BH2시리즈는 bulb centration이라는 불편함을 해결하기 위하여, pre-centered 할로겐 램프가 결합된 광원시스템을 채택하고 있습니다.

현미경의 기본 구성품은 observation tube, stage, 대물렌즈, 접안렌즈, 콘덴서, 광원장치 및 앞서 말한 모든 현미경 구성품을 결합하여 주는 stand가 있습니다. stand는 또한 초점 메커니즘이 포함되어 있습니다. 초기 현미경들은 초점을 맞추기 위해 draw tube나 대물렌즈들이 이동되었으나 최근 현미경에서는 그 적용범위를 넓혀 대물렌즈 뿐 아니라 stage를 이용한 초점 정합 작업이 일반적입니다.

대물렌즈의 배율이 증가함에 따라 보다 정확한 정밀도로 조정 가능한 초점 메커니즘의 발전이 필수가 되었습니다.

자동 pre-focusing 시스템은 올림푸스 BH2시리즈 부터 채택되어 focusing 절차를 단순화 하고 시간을 단축시켰을 뿐 아니라 대물렌즈가 표본과 접촉하지 않도록 도와주는 기능입니다.

BH2시리 현미경의 미동핸들은 한눈금에 2㎛씩 샘플과 스테이지가 상하이동합니다. 미동핸들은 조동핸들과 조합되어 편한한 초점 정합 작업(포커싱)을 가능하게 합니다.

Illuminating System

이제 현미경에서 사용하고 있는 조명장치에 대해 알아보기로 하자.

광학 현미경에서 대물렌즈와 접안렌즈의 성능은 매우 중요합니다만, 조명 시스템의 역할 역시 매우 중요한 역할을 하고 있습니다.

여기에는 Critical 조명과 Köhler(쾰러) 조명방식이라고 하는 두 가지 기본적인 조명방식이 있습니다.

Critical 조명 방식은 광원인 필라멘트의 이미지가 표본에 같이 결상니다. 이러한 시스템은 Köhler 조명 시스템보다 밝기는 뛰어납니다만, 조명광이 고르게 샘플을 비추지 못하며, 특히 저배율 렌즈에서는 그 현상이 심하게 나타납니다.

이러한 Critical 조명 방식을 개선하기 위한, 쾰러 조명 시스템( Köhler illumination )은 오늘날 사용할 수 있는 최고의 조명 방식으로 폭 넓게 받아들여지고 있습니다.

이 시스템에서는 광원 필라멘트의 초점이 콘덴서의 전초점 평면에 있는 aperture diaphragm에 모아지게 됩니다.

빛이 콘덴서와 대물렌즈를 통과한 후, 필라멘트의 이미지는 대물렌즈의 후측 초점면에 위치하게 됩니다.

그러므로, Köhler 조명방식은 Critical 조명방식에서 발생하는 불균등한 조명 문제를 해결 할 수 있습니다.

현미경 조명의 질에 영향을 미치는 중요한 요인은 대물렌즈의 N.A.값에 맞춰서 조명 시스템의 aperture값을 변화시키는 aperture iris diaphragm의 역할입니다

만약 aperture iris diaphragm이 너무 많이 닫혀 있으면, 높은 N.A값을 가진 대물렌즈의 기능을 제대로 사용할 수 없으며, 그 결과로 좋은 분해능을 얻을 수 없고, 상대적으로 이미지가 어둡게 보입니다.

반면에, 낮은 명암 또는 염색되지 않은 표본의 경우에는 aperture iris diaphragm(조리개)을 줄여서 명암을 향상시킬 수 있습니다.

한편, Field iris diaphragm는 보이는 부분에서 약간 바깥쪽 면에 위치하도록 열려 있어야 합니다.(중앙그림) 너무 많이 닫으면 보이는 부분이 iris diaphragm에 의해 가려지게 되고(왼쪽 그림) 너무 많이 열게 되면, 보고자 하는 영역외에 조사된 조명이 외부에서 영향을 미쳐서 flare를 형성할 수 있습니다.(오른쪽그림)

현미경의 condenser는 광원에 의해 방사된 빛을 집중시킵니다. 이때 콘덴서의 N.A.는 대물렌즈의 N.A.값의 70-80% 정도로 조정되어 있어야 합니다.

하나의 콘덴서로는 모든 대물렌즈의 배율에 대응할 수 없습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 4X 또는 더 낮은 대물렌즈를 위한 BH2-ULC 와 10배 이상의 배율을 가진 고배율의 대물렌즈를 위해 색수차와 구면수차를 보정한 BH2-AAC 콘덴서가 있다. (이 설명과 모델명은 구형 모델에 맞춰져 있습니다만, 시판되는 콘덴서에도 동일한 설명을 할 수 있습니다.)

(모든 현미경에 사용할 수 있는 콘덴서는 없습니다. 각각의 조건을 고려하여 적합한 콘덴서를 사용해야 합니다. )

Eyepieces

대물렌즈에 대한 지금까지의 지식을 기초로 하여 접안렌즈에 대해 알아보도록 하겠습니다.

현미경의 경우 대물렌즈에 의해 확대된 상은 접안렌즈 어깨부분에
서 10mm 떨어진 지점에 위치합니다. 이 상은 접안렌즈에 의해 한번 더 확대되게 됩니다. 대물렌즈가 일정한 경통길이와 동초점거리를 유지하도
록 설계된 것처럼 현미경 또한 대물렌즈에 의해 형성된 상의 위치가 ㄸEyepiece shoulder로부터 일정 거리를 유지하도록 디자인 되어 있습니다.

Eyepiece Diaprragm 영역은 접안렌즈를 통해 보여지는 시야 영역(Visual field)이며. 대물렌즈에 의해 확대된 1차 상이 결상되는 위치입니다. 이 영역의 크기에 따라 관찰되어지는 영역의 크기가 제한되어집니다.

㎜단위로 표현되는 접안렌즈 조리개의 직경을 시야수(Field Number-
F.N.)라 부르며, OLYMPUS 모델에서는 ‘W’는 wide field를 가리키며, SW는 26.5의 F.N값을 가진 super widefield 접안렌즈를 뜻합니다.

접안렌즈를 통해 관찰시 최적의 눈의 위치를 eyepoint라 부릅니다. 최근에는 안경을 끼고 관찰할 수 있도록 접안렌즈로부터 약간 떨어진 곳에 eyepoint가 위치하도록 디자인 되고 있으며, SWHK, WHK, CWHK와 같은 모델명 표기되어 있고, ‘H’로 표기되어 high eyepoint 접안렌즈 임을 알 수 있습니다.

접안렌즈는 WK10X와 같이 렌즈들 사이에 field diaphragm이 들어 있는 경우와, WHK10X와 같이 렌즈들 사이가 아닌 외부에 field diaphragm이 위치해 있는 경우 크게 2가지의 주요 타입으로 나눌 수 있습니다만, 최근의 접안 렌즈는 대부분 후자 타입입니다.

또한 접안렌즈의 image-forming plane에 micrometer disk 가 들어 있는 몇 가지 종류의 접안렌즈들을 제공합니다만, 원하는 포멧을 삽일할 수 있도록 설계되어 있는 것도 있습니다.

현미경은 세심하게 조합된 광학 시스템이고, 각 파트의 spec은 각각의 조합을 염두해 두고 계산되어 디자인한 것들이다. 그러므로 같은 종류의 대물렌즈와 접안렌즈를 잘 조합시켜 사용하는 것이 중요합니다.

Objectives

다음으로 대물렌즈에 관련하여 설명하도록 하겠습니다.

일반적으로 단일 렌즈에 의해 형성된 이미지는 왜곡되거나, 선명하게 결상하지 못하는 경향이 있습니다. 이 문제들은 렌즈의 고유한 특성이나, 수차에 의해 발생됩니다. 수차는 구면수차(spherical aberration), 상면만곡수차(field curvature), 코마수차(coma), 비점수차(astigmatism)와 상면왜곡수차(distortion)로 다섯개의 카테고리(자이델의 5수차)로 분류됩니다. 이러한 렌즈의 수차를 줄이기 위해서 조합된 렌즈를 사용하게 됩니다.

자이델의 5수차 외에도, 렌즈를 통해 들어온 빛의 파장에 따라 다른 굴절율을 가지기 때문에 발생하게 되는 색수차(chromatic aberration)가 있습다. 색수차는 축색수차(axial chromatic aberration)와 측면색수차(lateral chromatic aberration), 이 2가지 타입으로 구분됩니다. 축색수차는 다양한 파장으로 구성된 빛의 초점이 광축의 한 점에 모이지 않고 파장의 차이에 따라 다른 여러 개의 위치에 결상할때 발생합니다. 일반적으로 대물렌즈 가격의 저가 또는 고가의 분류는 색수차의 보정의 정도에 따라 구분됩니다.

오른쪽에서 우리는 축색수차(axial chromatic aberration)의 예를 볼 수 있다. 그림에서 보는바와 같이 색의 구분이 확실하지 않고 적색과 푸른색의 번짐이 흰색과 검정부분의 경계선마다 나타납니다.

색수차 보정을 위하여 볼록렌즈에 오목렌즈를 조합하여 색수차가 보정하여 모든 파장의 빛이 한 점에서 모이게 할 수 있습니다.

대물렌즈는 색수차 보정 정도에 따라 achromat, apochromat 이 두가지 타입으로 구분될 수 있다. achromat 대물렌즈는 붉은색과 파란색의 왜곡을 보정하는 기본 타입의 렌즈이다. 이 렌즈는 상대적으로 저렴하므로 교육용과 검사용 목적으로 널리 사용된다. 반면에 apochromatic 대물렌즈는 붉은색과 파란색 뿐 아니라 blue-violet색의 보정도 제공한다. 그러므로 고 품질의 이미지를 촬영해야만 하는 연구에 이상적이라 할 수 있습니다.

측면색수차(lateral chromatic aberration)는 파장에 따라 각기 다른 확대율로 확대될 때 발생한다. 측면색수차는 대개 시야부분 주위에서 많이 발생합니다. 이러한 왜곡의 보정은 대물렌즈 단독으로 할 수도 있고, 대물렌즈와 접안렌즈의 조합으로도 보정 할 수 있습니다. 후자의 방법이 이론적으로 뛰어난 것이 증명되었기 때문에 올림푸스 뿐 아니라 Zeiss, Leitz와 같은 현미경회사들이 모두 이용하는 방법이라 할 수 있습니다.

앞에서 언급한 자이델의 5수차 중 하나인 상면만곡수차(field curvature) 또한 보정될 수 있습니다. 상면만곡수차는 평평한 물체를 굽어 보이게 하여 보이는 부위의 중앙부분에 초점을 맞췄을 때 주위의 초점이 흐려져 보이는 경우입니다. 상면만곡수차를 보정한 대물렌즈는 렌즈 표면에 PLAN 또느 PL이라고 표시 되어 있습니다.

다음 그림 중 왼쪽은 Plan achromat 대물렌즈, 오른쪽은 achromat 대물렌즈에 의해 관찰된 이미지입니다. 이 이미지의 중앙부분은 큰 차이가 없습니다만, 오른쪽 이미지의 외곽 부분은 초점이 약간 벗어나 보입니다.

생물학적, 병리학적으로 사용된 표본은 보통 0.17mm 두께의 cover glass로 덮여 있지만, 혈액표본과 같은 일부 표본은 cover glass를 사용하지 않습니다. 저배율 대물렌즈는 큰 영향이 없습니다만, 배율이 올라갈수록 cover glass의 유, 무는 이미지 관찰에 큰 영향을 주기 때문에, 대물렌즈에서 요구하는 조건의 샘플을 사용하여야 합니다. (대물렌즈 구매시에는 반드시, 자신의 샘플의 조건에 부합하는 대물렌즈를 선택해야 합니다.)

그러므로, 대물렌즈는 사용되는 표본의 type을 분명하게 표시하고 있다. 0.17 표시는 0.17㎜의 cover glass로 덮혀 있는 표본의 관찰에 최적화되어 있다는 뜻이고 ‘0’ 마킹은 cover가 반드시 없어야 한다는 뜻입니다.
몇몇 오일 타입과 작은 N.A값의 저배율 대물렌즈는 cover glass의 유무에 큰 영향을 받지 않습니다. 이러한 대물렌즈는 ‘-’라고 대물렌즈에 표시되어 있습니다.

그러나 높은 N.A.값을 가진 고배율의 건식 대물렌즈는 cover glass 두께에 약간의 변화만 있어도, 구면수차가 발생되게 되어 이미지의 명암과 선명도를 급격히 저하시킵니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 일부 대물렌즈는 구면수차를 보정하기 위한 기능을 추가하여 설계되어 있습니다.

(대물렌즈에 correction collar라고 불리는 보정환이 포함되어 있어서, cover glass의 두께가 바뀌어도 수차를 보정할 수 있는 유닛입니다. )

높은 N.A.값을 가진 대물렌즈로 최고의 해상력을 얻기 위해서는 대물렌즈와 cover glass, 표본과 condenser 사이의 굴절률(n)은 1보다 커야 합니다. 그래서 cover glass의 굴절율과 비슷항 immersion oil(굴절율 1.515)이 사용되는 것입니다.

고배율 대물렌즈는 작동거리(W.D.)가 매우 짧습니다. 이런 이유로 대물렌즈와 표본의 접촉시 생길 수 있는 손상을 방지하기 위하여 ,스프링이 장착된 대물렌즈를 사용하기도 합니다. (오른쪽 이미지는 샘플이 너무 올라와서 대물렌즈 끝단을 누르고 있는 모습입니다.)