Numerical Aperture , Resoving Power , Depth of Focus

이제, 개구수(Numerical Aperture), 분해능(Resolving power), 심도
(Depth of Focus)에 대한 설명으로 넘어 가겠습니다.

이론상으로 확대율은 거의 무한하게 증가될 수 있지만 만약 확대했을 때 이미지가 선명하지 않으면 그것은 의미가 없는 것이라 할 수 있습니다. 이미지의 선명함을 결정하는데 있어 중요 요인으로 꼽히는 것은 대물렌즈의 분해능입니다. 이 분해능은 대물렌즈의 개구수(N.A)에 의해 결정됩니다.

개구수(N.A)는 실제로 대물렌즈의 밝기와 분해능에 영향을 주고, 카메라 렌즈의 조리개값(F-number)으로 이해 할 수 있습니다. 개구수는 표본과 대물렌즈 사이 물질의 반사지수를 나타내는 상수값 n과 그 각도 α의 sine값에 의해 결정됩니다. 건식(Dry)타입은 매개물질이 공기이므로 굴절율 1을 갖습니다. 반면에 오일타입의 대물렌즈는 대개 굴절율 1.515와 같은 값을 가진다. α는 대물렌즈의 광학축을 기준으로 기울어진 광원의 입사 각도입니다.

이런 까닭에 개구수(N.A)는 대물렌즈의 분해능에 큰 영향을 미칩니다. 분해능의 두 점을 두점을 두 점으로 인식할 수 있는 최소 거리입니다.

우리가 두 점 사이의 분해거리(resolved distance)를 ∆R이라 부른다면, 여기서 λ는 빛의 파장길이, K는 상수이다. 파장 변화가 없는 상태에서 개구수 값을 올리면 보다 작은 ∆R값을 얻을 수 있다. 광학 현미경의 최소 분해한계 거리는 대략 0.25㎛ 입니다.

개구수(N.A.)값의 증가는 한계가 있으므로 빛보다 짧은 파장의 전자빔을 이용, ∆R값을 보다 감소시킬 수 있다. 이 이론이 광학현미경보다 1000배 이상의 분해능을 가진 전자현미경의 원리이다. 그러나 전자현미경은 살아있는 표본 관찰이 어렵고, 표본을 준비하는데, 전처리가 필요하며, 염색할 수가 없고 가격이 매우 비싼편에 속합니다. 이런 이유로에 광학현미경과 전자현미경은 상호보완적으로 사용되어 지고 있습니다.

현미경 설계에서 중요한 다른 요소는 한번에 초점을 잡을 수 있는 최대깊이인 초점의 심도(depth of focus)입니다. 보다 큰 초점 심도는 두꺼운 표본의 관찰을 용이하게 합니다. 그러나 초점심도는 대물렌즈의 배율과 개구수에 반비례한 특성이 있습니다. 따라서, 배율과 분해능이 커질수록 심도는 얇아진다는 것을 의미합니다.

Mechanical Tube Length, Parfocality, Parcentration

이제 기계적 경통거리(Mechanical tube length), 동초점(Parfocality)과 Parcentration에 대한 설명으로 넘어 갑니다.

이 그림에서 보는 바와 같이 ,기계적 경통 거리(Mechanical Tube Length)는 대물렌즈의 나사선이 시작되는 부분부터 접안렌즈를 하우징하는 슬리브 상단까지의 거리이다.

현미경 제조업체는 배율이 다른 여러개의 대물렌즈를 교체하여 사용할 수 있게 고정된 파포컬 거리(동초점_Parfocality)와 기계적 튜브 길이(Mechanical Tube Length)를 유지하도록 현미경을 설계합니다.

올림푸스의 LB시리즈 대물렌즈(구형 대물렌즈)들의 경우 1X에서 100X 대물렌즈의 배율에 이르기까지 동초점을 정확하게 유지되기 위해 초점거리 즉, 대물렌즈 어깨부분부터 표본까지의 거리가 45mm로 설정된다.

(이런 설계 덕분에 대물렌즈 배율을 바꾸더라도 초점이 맞는 상태를 유지할 수 있다.)

사용편이성을 위한 다른 요소로는 대물렌즈의 배율이 바뀔 때 마다 보이는 영역의 중앙을 유지시켜 주는 Pacentration 기능이 있습니다.

현미경 디자인의 다른 중요한 성능으로 작동거리(working distance)가 있으며, 이것은 샘플에 포커스를 맞추었을때, 대물렌즈 끝단과 커버글라스(덮개유리)의 윗부분의 거리를 말합니다. 일반적으로 저 배율의 대물렌즈가 보다 긴 작동거리를 각게 됩니다.
그리고, 작동거리가 길수록 샘플에 초점을 잡을 때, 대물렌즈가 표본 슬라이드에 부딪혀 파손되어버리는 실수를 줄일 수 있습니다.

Optical Principle of The Microscope

지금까지 우리는 현미경 발전의 역사에 대해 간단하게 알아봤습니다. 이제 우리는 현미경의 구조에 대해 알아보고자 합니다. 유용한 광학이론들에 대한 설명을 간단하게 시작해 보겠습니다.

모든 볼록렌즈는 양쪽면에 하나씩 2개의 초점을 가지고 있습니다. 만약 물체가 전측초점인 (F)로부터 먼 곳에 위치해 있다면 렌즈의 반대편에 역상이 맺히게 됩니다. 이 역상을 실상(real image)라 부른다. 만약 물체가 전측초점과 렌즈 사이의 위치하면 이미지는 렌즈의 반대쪽에 초점이 잡히지 않고 같은 쪽에 결상하는 것처럼 보이게 된다. 이때 반대쪽에서 보면, 샘플은 확대되어 보이는데 이것을 허상(virtual image)이라 합니다.

복합현미경으로 돌아가서 우리는 대물렌즈에 의해 확대된 이미지가 접안렌즈에 의해 더욱 확대된다는 것을 언급하였습니다.

이 그림은 확대과정을 좀 더 세부적으로 보여줍니다. 여기에 선 A’B’는 견본 AB의 뒤집어진 real image(실상)를 가리킨다. Mob라 불리는 대물렌즈의 확대율은 A’B’/AB로 주어진다. 확대율은 또한 공식 Mob=ℓ/fob를 사용하여 구해질 수 있다. 여기서 ℓ은 F’ob로부터 real image까지의 거리이고 fob는 대물렌즈의 초점거리이다. 거리 ℓ은 또한 Optical tube length로 불리며, 대물렌즈의 종류와 스펙에 따라 다양하게 설계 됩니다.

실상이미지 A’B’ (역상)가 접안렌즈에 의해 두번째로 확대될 때 우리는 A”B”를 얻습니다. 접안렌즈의 확대율을 결정하기 위해서 우리는 A”B”를 A’B’로 나눈다. 대물렌즈의 경우와 같이 접안렌즈의 확대율은 다음의 공식 Moc=250/foc로 계산될 수 있습니다.

그런 이유로 현미경의 총 확대율 M은 M=ℓ/fob×250/foc라는 공식을 얻게 됩니다. (참고로 여기서 250은 250㎜를 의미하며, 접안렌즈로 보았을때 샘플의 확대상이 250㎜ 거리에 결상하도록 미리 설계한 값이라 볼 수 있습니다. 추가로 설명하면, 눈과 A”B”의 거리가 250㎜가 되도록 설계한 것입니다.)

현미경의 종류

지금은 생물학적, 의학적 목적으로 사용되는 표준 현미경 외에도 다양한 종류의 현미경이 있습니다.

예를 들면 세포배양의 관찰과 촉진을 위한 도립형 현미경(상기 이미지_구형 모델)이 있으며,

다양한 현미경(상기 이미지_현재 시판되고 있는 모델)이 개발되어 바이오 시장에서 사용되어 지고 있습니다.

금속 및 산업현미경시장에서는 반사관찰을 위주로 한 현미경이 사용되어 지고 있으며, 정밀 측정을 위한 측정현미경(또는 공구현미경) 또한 정밀 품질 관리를 위하여 사용되어 지고 있습니다.

실체 현미경(상기 이미지_구형모델)은 미세한 물체의 입체적인 관찰을 가능하게 하며 반도체 산업, 정밀공학, 생명공학 등의 분야에서 널리 사용되고 있다.

현재 시판되고 있는 실체 현미경은 저렴한 모델에서 부터 연구용의 고가 모델까지 다양한 목적에 맞추어 사용되어질수 있도록 다양한 모듈의 선택이 가능합니다.

관찰기술은 지속적인 진보가 이루어져 오면서, 명시야 관찰(Bright Field_일반인들이 상상하는 현미경 관찰은 대부분 이 관찰법을 생각하실 수 있습니다.), 뿐만 아니라 암시야(Bright Field), 위상차(Phase Contrast), 미분간섭 관찰(DIC), 편광(Polarizing), 형광 관찰(Fuorescence)로 진보하여 왔으며, 보다 세분화 되어진 복잡한 구성의 현미경들도 많이 사용되어 지고 있습니다.

History of The Microscope

옛날부터, 사람은 맨눈으로 볼 수 있는 것보다 더 작을 것을 볼 수 있기를 원했다

16세기에 이르러 이러한 관심은 단일 볼록 렌즈로 만들어진 확대경을 만들어냈고, 결국 현미경의 개발로 이어지게 되었다.

현미경의 역사에서 가장 유명한 선구자는 아마도 영국의 Digges와 네덜란드의 Zacharis Janssen 일 것이다.

그러나 실제 현미경을 만들고 사용한 최초의 인물은 Antony Van Leeuwenhoek이다. 레이우엔훅은 작은 유리 볼을 가공하여 270X배율을 가진 세계 최초의 현미경을 만들었다.

Leeuwenhoek의 현미경은 오직 하나의 렌즈를 가지고 있었기 때문에 지금은 단렌즈 현미경이라 불리운다. 이 현미경은 볼록 렌즈를 금속 홀더에 장착하였고, 나사선를 이용하여 초점을 맞추었다.

그는 역사적 발명 이후에도, 계속 현미경 기초 연구에 헌신했다. 그의 발견은 박테리아를 포함하여 bellanimalcules (균의 일종) 그리고, spermatozoa(정자)와 같은 것들로 이어졌으며, Leeuwenhoek는 그의 인생 동안 약 400여개의 현미경을 만들어냈다.

Leeuwenhoek이 발명한 현미경과 같은 단안렌즈 현미경의 확대율 계산은 단순 확대경의 확대율 계산법과 같은 방법으로 계산된다. 상기 이미지와 같이 250㎜는 렌즈의 초점 거리에 의해 나누어진다. (여기서 250㎜는 사람의 눈에 있어 가장 보기 편한 초점 거리로 상정하여 고안된 것입니다. 독서 할 때 편한 책의 위치와 같은 개념으로 보시면 됩니다.)

단일 복록렌즈 현미경의 확대율을 증가시키기 위해서는, 렌즈의 초점 거리를 줄어야 합니다만, 초점 거리가 감소함에 따라 렌즈의 직경도 감소되어야 합니다. 배율의 확대를 위하여 렌즈의 직경이 너무 작아지면 이를 통한 확대 관찰이 어려워 집니다.

이 문제를 해결하기 위해서, 17세기에 복합현미경 시스템이 개발되었습니다. 이러한 방식의 현미경은 하나 이상의 렌즈를 조합하여, 하나의 렌즈에 의해 확대된 이미지를 또 다른 렌즈가 더욱 확대시키는 방식입니다.

오늘날 현미경이라 하면 보통 이러한 복합 현미경을 지칭합니다.

복합 현미경에서 표본에 접한 렌즈를 ‘Objective_대물렌즈’ ,
눈에 접한 렌즈를 ‘Eyepiece_접안렌즈’ 라고 부른다.

복합 현미경 발명 이후 그것은 과학 발전에 지대한 공헌을 하게 하였다. 복합 현미경을 이용하여, 17세기 영국의 Robert Hooke은 살아있는 것들은 세포로 구성 되어 있다는 것을 발견하였습니다.

의료계에서는 프랑스의 Louis Pasteur가 복합 현미경을 사용하여 효모균을 발견하였고, 독일의 세균학자 Karl J. Eberth는 Ebethella Typhosa(장티푸스로 의심되는 간균)를 발견하였다

Robert Koch가 결핵과 콜레라균을 발견하는 데도 복합 현미경이 도움을 주었다.

현미경의 개발은 19세기에 극적인 진전을 보였는데, 현미경 제작에 큰 노력을 기울인 칼 자이스, 광학 원리에 대한 이론적 연구를 수행한 에른스트 아베, 광학 유리에 대한 연구를 수행한 오토 스코프트와 같은 위대한 연구자들의 공헌 덕분이었다.