위상차 현미경 관찰법

Phase contrast Microscopy

위상차 관찰법 발명자 정보

– Frits Frederik Zernike(네덜란드 과학자)
– 위상차 현미경 발명으로 노벨물리학상(1953)을 수상.

발명 배경

생물현미경에서 사용하는 대부분의 샘플은 무색투명한 특성을 가지고 있기때문에, 배율확대 만을 목적으로 하는 일반 현미경의 관찰법(Bright Field)에서는 투명하고 윤곽이 흐릿하게 보이기 때문에 제대로 된 관찰에 어려움이 있습니다.

이 문제를 해결하기 위하여 샘플을 염색하는 방법이 사용하고 있습니다만, 이 방법으로는 살아있는 샘플의 관찰은 할 수 없습니다. 염색 도중에 샘플이 죽어버리기 때문입니다.

위상차 현미경의 (개요)

위상차 관찰법(Phase-Contrast)은 샘플을 통과하는 직진광(하단 좌측 이미지)과 이 직진광이 샘플에 통과하면서 발생하는 회절광(하단 우측 이미지) 사이의 위상차 현상을 이용하여 살아있는 세포의 구조와 미생물의 상태변화를 볼게 있게 해주는 관찰법입니다.

위상차 현미경의 원리 설명

샘플의 한 포인트(샘플 평면 중의 한 점)를 통과하는 빛은 두 개의 광학 경로를 가지도록 설계 되어 있으며, 이 두개의 경로를 통과한 빛은 한점에 다시 한 점에 모여 확대된 상을 만들게 되지만, 다른 경로를 지나왔기 때문에 발생한 위상차에 의하여 보강 또는 소멸 간섭을 하게 된다.

하단의 좌측이미지는 두개의 광학경로 중에 직진광의 경로이며, 하단의 우측이미지는 직진광이 샘플에 닿을때 발생하는 회절광의 경로이다. 참고로 직진광이 샘플이 없는 포인트를 지나가게 되면 산란이 생기지않아 회절광은 발생하지 않는다.

회절광은 직진광의 위상에 비교하여 대략 1/4λ 지연되어 결상한다. 직진광은 위상판에 의하여 1/4λ 또는 3/4λ지연되어 결상한다.

직진광이 위상판에 의하여 1/4λ 지연되어 회절광과 동일한 위상을 갖게 되면 직진광과 회절광의 위상이 서로 보강간섭을 하여 진폭이 커지게 되면 배경에서는 직진광의 영향만 받기 때문에 샘플이 배경 보다 밝게 보인다. (Negative contrast)

반대로 직진광이 위상판에 의하여 위상이 3/4λ 지연되면 직진광과 회절광은 소멸 간섭을 하게 되어 샘플은 직진광의 영향만 받는 배경보다 어둡게 보인다. (Positive contrast)